梯度洗脫是指在同一個分析周期中隨著時間的變化按一定程序梯度性地改變洗脫液的比例(濃度配比、成分、離子度、溶液性等)或pH，以期將層析柱上不同的組分洗脫出來的方法。從而可以使一個復雜樣品中性質（性）差異較大的組分能按各自適宜的容量因 子k達到良好的分離目的。梯度洗脫一般分為二元壓梯度，二元低壓梯度和四元低壓梯度；二元壓梯度需要兩臺壓泵，二元低壓梯度和四元低壓梯度都是只需要一臺壓泵和一個比列閥。

 　梯度洗脫的原理如下：
 　具體地講，當樣品隨梯度起點的流動相進入色譜柱入口時，由于起點流動相中弱洗脫溶劑A含量較，洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適中)和化合物C2(保留較)因分配系數(k值)較而滯留于色譜柱入口附近，幾乎未移動。一段時間后，B增加到一定數值，C1的k值達到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長多，但C1的的平均k值卻小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較水平。B持續增加，在隨后的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較水平。
流動相的梯度變化即流動相性、PH值等的梯度變化，即洗脫能力成梯度變化。

 　梯度洗脫配置相對復雜，配置特點：
 　1. 二元壓梯度洗脫需要配置兩臺壓泵，一個混合器及連接管理，配置較，成本；
 　2. 二元低壓梯度洗脫需要配置一臺壓泵、一個二元比例閥、一臺在線脫氣機、一個混合器（脫氣機和混合器視情況而定，可不選）及連接管路，配置較低，成本較低；
 　3. 四元低壓梯度洗脫需要配置一臺壓泵、一個四元比例閥、一臺在線脫氣機、一個混合器（視情況而定，可不選）及連接管路，配置較，成本較低。